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Microcopia de Campo Oscuro

Microcopia de Campo Oscuro Madrid

El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El objeto iluminado dipersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada. Por ello las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje óptico que conecta el espécimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. También es bastante utilizado en la observación de muestras metalográficas para la observación de detalles en superficies con alta reflectancia.
El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrás de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.
El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite incluso distinguir partículas más pequeñas que el poder separador del sistema óptico usado por transparencia. 


El microscopio de campo oscuro se encuentra catalogado entre los microscopios ópticos.
Desde muchos años atrás el microscopio óptico posibilito el descubrimiento de las células y la elaboración de la teoría de que todos los seres vivos están constituidos por células.
El microscopio òptico se compone de dos partes principalmente:
1. Parte Mecánica: Sirve de soporte.
2. Parte Óptica: constituida por tres sistemas de lentes.
* Condensador
* Objetivo
* Ocular 


El condensador del microscopio óptico convencional tiene como finalidad proyectar un cono de luz sobre los elementos que están siendo analizados en el microscopio. Después de atravesar el elemento, ese haz luminoso en forma de cono penetra en el objetivo, proyectando una imagen aumentada en el plano focal del ocular ,que nuevamente la amplia y es recibida por la retina como una imagen situada a 25 cm de la lente ocular.


El microscopio de campo oscuro esta constituido por un microscopio óptico al cual se le acondiciona un condensador especial, este tiene como fin producir una disfracen de los rayos luminosos enviándolos lateralmente sobre el objeto en forma de un cono luminosos, y de esta forma tampoco penetran directamente al objetivo.
Existen dos clases de condensador de campo oscuro:
* Cardiode


* Paraboloide.
Ambos son utilizados con el mismo fin, pero el cardiode tiene mayor aplicabilidad en la investigación con Treponemas.
Para que el efecto de campo oscuro se logre , la apertura numérica del condensador debe ser mayor que la de el objetivo, lo cual ocurre con los objetivos de pequeño y gran aumento no así con los de inmersión los cuales deberán adicionarse de un diagrama de suspensión para la reducir la apertura numérica.

RESOLUCIÓN DE MICROSCOPIA EN CAMPO OSCURO
Se llama poder de resolución de un sistema óptico a la capacidad de separar detalles y es expresado por el limite de resolución que es la menor distancia que existe entre dos puntos para que estos aparezcan individualizados.
Lo que determina la riqueza del detalle de la imagen provista por un sistema óptico es su limite de resolución y no su poder de aumentar el tamaño de los objetos.
El limite de resolución depende de la apertura numérica (AN) del objetivo y de la longitud de onda de la luz utilizada.
En la microscopia de campo oscuro la AN no debe ser superior a 1.0 ya que el condensador debe tener siempre una apertura numérica superior a este valor. El limite de resolución del objetivo esta dado por la siguiente formula: LR = k x Long. onda / AN
* k = Constante ( 0.61)
* Log. onda = 0.55 Se toma la longitud de onda de la franja verde - amarilla por ser el ojo humano mas sensible a estos colores que a otros.
* AN = Apertura numérica no superior a 1.0

MÉTODOS PARA OBSERVACIÓN EN FONDO OSCURO
Existen diferentes métodos para observar un objeto sobre un fondo oscuro , es decir, utilizando únicamente la luz difractada por él.


OBSERVACIÓN INCIDENTE O POR REFLEXIÓN
La observación por reflexión con iluminación oblicua o anular es la mas frecuentemente utilizada con los microscopios estereoscopios o lupas binoculares. Generalmente no nos damos cuenta de que observamos en fondo oscuro cuando el material ocupa todo el campo visual.

OBSERVACIÓN POR TRANSMISIÓN (Fondo Negro Central)
La observación por transmisión con una pantalla central necesita la utilización de un objetivo con pantalla interna de Spierer; con una pantalla anular , la de Wilska: anoptral, versión original y no la fabricada industrialmente que es un contraste de fase negativa a fuerte absorción.


OBSERVACIÓN POR TRANSMISIÓN (Fondo negro Anular)
La observación con iluminación anular de abertura superior a la del objetivo, es la única que, en la practica corriente , se denomina campo oscuro. Debe indicarse que difícilmente puede utilizarse objetivos de gran aumento , de apertura numérica superior a 1.0. dado que el condensador debe presentar una abertura superior a esta. Debe entonces practicarse la inmersión, evitando las burbujas de aire.

OBSERVACIÓN BIRREFRINGENTE ( Polarización)
La observación de un objeto birrefringente entre nicoles cruzados da una imagen sobre fondo negro de naturaleza muy particular.

OBSERVACIÓN HAZ PERPENDICULAR (Fondo Negro ultramicrosopico)
La observación con un haz perpendicular a la dirección de la observación según Ziedentopf y Szimondy da informaciones sobre la orientación de las partículas observadas.

Accesorios de campo oscuro
Usados principalmente para especimenes no coloreados que son semitransparentes o transparentes.


NATURALEZA Y ESTRUCTURA DE LA IMAGEN EN FONDO OSCURO
Las imágenes en autentico fondo negro son remarcables por un efecto de borde ,con numerosas franjas de difracciòn muy brillantes si le objeto es refringente. Los planos ,en el centro de una estructura parecen ópticamente vacíos . es por ello que deben adoptarsen grandes precauciones en el momento de interpretar las imágenes . Dado que la imagen solo se forma con las luz difractada, siempre más débil que la luz directa deben formarsen fuentes lumìnicas muy intensas, lo que no siempre es fácil sobre todo cuando los objetos son vivos y, por consiguiente, sensibles a fuertes iluminaciones.


PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y PROCEDIMIENTO DE LECTURA.
El material a estudio se emulsiona sobre un porta-objetos sobre el cual se coloca una gota de solución salina, se cubre con una laminilla y se monta sobre la platina , se baja el condensador de campo oscuro y se corre con el carro de la platina la preparación de forma tal que al subir completamente el condensador la cara superior de su lente quede cubierta por su preparación solamente en su mitad posterior.
Sobre la parte descubierta del lente se coloca aceite de inmersión en cantidad adecuada; este por capilaridad se extiende entre la cara inferior del portaobjetos y la superior del lente del condensador. Se centra la preparación y se observa con objetivo de pequeño aumento colocando el foco luminoso en la mitad del campo mediante los tornillos de centraje del condensador, luego se observa el campo microscópico con el objetivo de gran aumento, esto permite conocer el estado del microscopio al observar los treponemas bucales.


VENTAJAS
* Permite ver partículas dipersas en un medio homogéneo.
* Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas.
* Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear.
* Visualiza los bordes destacados delas muestras.
* Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum, espiroquetas con diámetros superior a 0.2 um.


DESVENTAJAS
* Inadecuada preparación de la muestra.
* Difícil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo.
* No deja visualizar estructuras celulares especificas, solo bordes de células o partículas.